liceogalileinardo.it

  

Bästa artiklarna:

  
Main / Hela ex ome fånga en

Hela ex ome fånga en

Jamie K. Teer, James C. Mullikin, Exome-sekvensering: Utvecklingen av massivt parallella sekvenseringsteknologier, i kombination med nya massivt parallella DNA-anrikningstekniker genomisk infångning, har möjliggjort sekvensering av riktade regioner i det mänskliga genomet i snabbt ökande antal prover.

Genomisk infångning kan rikta in sig på specifika områden i genomet, inklusive gener av intresse och kopplingsregioner, men detta begränsar studien till vad som redan är känt. Exome fångst möjliggör en opartisk undersökning av de kompletta proteinkodande regionerna i genomet. Forskare kan använda exome-fångst för att fokusera på en kritisk del av det mänskliga genomet, vilket möjliggör större antal prover än vad som för närvarande är praktiskt med helgenomsekvensering.

I den här översynen beskriver vi kort några av de metoder som för närvarande används för genomisk och exome-fångst och belyser de senaste tillämpningarna av denna teknik. Introduktionen och den utbredda användningen av massivt parallell sekvensering har gjort det möjligt för enskilda laboratorier att sekvensera ett helt humant genom. Men kostnaden och kapaciteten som krävs är fortfarande betydande, särskilt med tanke på att funktionen hos mycket av genomet fortfarande är i stort sett okänd.

Innan massivt parallell sekvensering riktades specifika regioner i genomet med PCR, följt av kapillär sekvensering.

Detta tillvägagångssätt var effektivt för att begränsa omfattningen av utredningen, men krävde en noggrant definierad gissning om vilken region som skulle riktas. Studier i större skala har använt denna metod [X-kromosom exons 1, human exome 2], men detta är fortfarande ett stort åtagande som inte är genomförbart för många forskargrupper. Sådana metoder, beskrivna som genomfångning, genomuppdelning, genomberikning etc. Även om dessa metoder kan täcka mer av det mänskliga genomet på kortare tid till reducerad kostnad jämfört med PCR, kräver de också en utbildad gissning om vilka regioner eller gener kan vara intressant.

I fastfas-hybridiseringsmetoder används i allmänhet sonder som är komplementära för de sekvenser av intresse som är fästa på ett fast underlag, såsom mikroarrays 7-11 Fig.

Det totala DNA: t appliceras på sonderna, där de önskade fragmenten hybridiserar. De icke-riktade fragmenten tvättas därefter bort och det anrikade DNA elueras för sekvensering. Nyligen har dessa metoder förbättrats med flera anrikningscykler 13, 14. Illustration av olika fångningsmetoder. Ljusblå staplar representerar önskad genomisk sekvens, röda staplar representerar oönskad sekvens. En fastfashybridisering. Betesonder ljusblå och svart komplement till önskad sekvens syntetiseras på en mikromatris.

Fragmenterat genomiskt DNA appliceras och de önskade fragmenten hybridiseras. Matrisen tvättas och önskade fragment elueras. B Vätskefashybridisering. Betesonder ljusblå och svart som kompletterar de önskade regionerna syntetiseras, ofta med hjälp av mikroarray-teknik.

Sonderna är i allmänhet biotinylerad asterisk. Betesonderna blandas med fragmenterat genomiskt DNA och de önskade fragmenten hybridiseras till beten i lösning.

Streptavidin pärlor svarta cirklar läggs till för att möjliggöra fysisk separation. Pärl-bete-komplexen tvättas och önskat DNA elueras. C MIP. Enkelsträngade sonder som består av en universell länk-ryggrad svart linje och armar som kompletterar sekvensen som flankerar önskade regioner rött och vitt syntetiseras, ofta med användning av mikroarray eller mikrofluidik-teknik.

Sonderna läggs till genomiskt DNA och hybridiseras på ett inverterat sätt. Ett gult oval av polymeras fyller gapet mellan de två armarna. En ligasgul stjärna förseglar nicket, vilket resulterar i en sluten enkelsträngscirkel. Genomiskt DNA smälts med exonukleaser och det infångade DNA amplifieras med hjälp av sekvenser i det universella ryggraden. D PEC. Biotinylerade primers röda och vita tillsätts till fragmenterat genomiskt DNA, där de hybridiserar till önskad sekvens. En polymerasgul oval förlänger grundfärgen, vilket skapar en stramare interaktion.

Det önskade DNA: t elueras sedan. Vätskefashybridisering liknar fast fas; sonderna i denna metod är inte bundna till en fast matris, utan är istället biotinylerade. Fig. Efter hybridisering binds de biotinylerade sonderna med det komplementära önskade genomiska DNA till magnetiska streptavidinpärlor och separeras från det oönskade DNA genom tvättning. Efter eluering kan anrikat DNA sekvenseras. Även om alla infångningsmetoder använder polymeraser för att amplifiera fångade fragment, använder dessa metoder polymeraser på ett mer integrerat sätt.

Denna metod använder en biotinylerad primer med kompletterande sekvens för DNA av intresse. Efter glödgning förlängs primern och genererar effektivt en hybridiseringssond för att fånga sekvensen av intresse som andra hybridiseringsmetoder 21. Mycket parallell PCR har varit en effektiv metod för att förbereda prover för kapillär sekvensering, och det senaste arbetet har utökat denna idé med mikrofluidik.

Istället för att använda plattor med hundratals brunnar kan vattenhaltiga mikrodroppar separera tusentals enskilda reaktioner i samma rör, vilket möjliggör en mycket mer parallell användning av PCR 22 som är kommersiellt tillgänglig från Raindance. Ett annat kommersiellt tillgängligt kit använder restriktionsenzymer för att fragmentera DNA; sönder specifika för ändarna av önskade fragment används för att amplifiera den önskade sekvensen Olink Genomics.

Det finns andra metoder för att isolera större delar av genomet. Kromosomsortering som granskats i 23 har länge varit användbart för genomik. Massivt parallell sekvensering är väl lämpad för sekvensbibliotek som genereras genom fragmentering av flödessorterade kromosomer och erbjuder ett sätt att sekvensera en enda kromosom. När udda kromosomstrukturer är närvarande, eller DNA bara är tillgängligt från en handfull molekyler, har mikrodissektion av metafaskromosomer följt av sekvensering rapporterats 24.

Även om dessa metoder kräver mycket specialiserade instrument, erbjuder de ett kraftfullt tillvägagångssätt för unika fall. Även om många olika metoder för målinriktad fångst har beskrivits, har endast få utvidgats för att rikta det mänskliga exomet.

I framtiden kan andra metoder också kunna skala upp också. Detta är en mer konservativ uppsättning gener och inkluderar endast proteinkodande sekvens. Båda företagen riktar sig också till utvalda miRNA och extra regioner kan ibland läggas till Agilent. Även om det fortfarande är en delmängd av genomet, tillåter exome-infångning utredningen av en mer komplett uppsättning mänskliga gener med kost- och tidsfördelarna med genomfångning.

Efter de inledande metodbeskrivningarna använder nuvarande forskning metoder för att fånga genom genom olika frågor. Från orsakssjukdom och diagnos till evolutionär jämförelse av forntida genom, genomtagning och massivt parallell sekvensering är ett kraftfullt undersökningsverktyg. Ett av de vanligaste exome fångstexperimenten är sökandet efter genetisk variation som ligger bakom en viss sjukdom. För vissa sjukdomar har orsakande gener identifierats, och forskare kan använda anpassade fångster för att undersöka dessa gener för kända och nya varianter i sina prover.

För andra sjukdomar är hel exome-infångning lämplig, eftersom den orsakande genen är okänd eller många olika gener kan bidra. Flera nya studier har fångat upp och sekvenserat olika regioner av enskilda genomer med kända orsakssammanhang eller gener. Dessa bevis på principexperiment visar nyttan, såväl som vissa brister, av fångst följt av massivt parallell sekvensering.

Ng et al. Studien omfattade fyra orelaterade individer med Freeman-Sheldons syndrom, en dominerande ärftlig sällsynt Mendel-störning.

Utredarna kunde identifiera varianter i den kända orsakande genen i varje prov. Intressant var att den kända orsakande genen var den enda kandidaten efter appliceringen av många filter, inklusive att kräva att en gen hade en ny variant i varje prov. I sin studie av neurofibromatos typ 1, Chou et al. Författarna fångade DNA från två olika prover med kända genotyper, men kunde initialt bara återställa en känd enbaserad radering.

Den andra kända varianten, en Alu-sekvensinsättning, observerades först efter de novo-montering av ommappade läsningar. Dessutom hittade författarna många positioner där de fångade genotyperna inte överensstämde med Sanger-sekvenseringsbekräftelser.

De fann att medan vissa avvikelser berodde på pyrosekvenseringsfel, var andra felinriktningar från de många pseudogenerna i NF1, vilket illustrerar en av metodens potentiella fallgropar. Hoischen et al. En känd variant av trinukleotidupprepning inkluderades inte i designen på grund av dessa varianters repetitiva karaktär och återhämtades därför inte. Raca et al. De kunde identifiera en känd substitution med hjälp av den medföljande mjukvaran för sekvenseringsanalys, men återhämtade inte den kända enbaserade borttagningen i en homopolymerkörning, trots att de såg läsningar innehållande varianten.

Andra analyspaket kunde identifiera varianten. Även om dessa studier inte var utformade för att identifiera nya varianter som orsakade sjukdomen, kan mycket läras av dem. Det är viktigt att inte alla kända varianter återhämtades. Detta berodde på lågt sekvensdjup vid variantpositionen, såväl som problem med upprepade regioner och inriktning. För att säkerställa tillräcklig allelprovtagning, samt för att förhindra att sekvenseringsfel verkar vara verkliga varianter, använder eller rekommenderar alla fyra studierna ett minsta sekvensdjuptröskel, som sträcker sig från 8- till 30-faldigt täckningsdjup.

Dessa rekommendationer kommer att påverka mängden sekvensering som krävs för en given fångstorlek och påverkar därför kostnaden för experimentet. Riktad fångst har också använts för att identifiera nya gener som orsakar ärftliga störningar. Volpi et al. Intressant nog är Johnston et al. Dessa studier visar genomisk fångsts förmåga att upptäcka olika typer av nya varianter som är viktiga för mänsklig sjukdom.

Förutom anpassade fångststudier har två hela exome-studier nyligen rapporterats. I den första, Choi et al. Varianten var en homozygot missensubstitution i SLC26A3, en gen där mutationer är kända för att orsaka medfödd kloridförlorande diarré 25.

Detta genetiska resultat gjorde det möjligt för forskarna att korrigera en tidigare diagnos av patientens störning. Varianter i samma gen var närvarande hos andra individer, vilket möjliggjorde den korrigerade diagnosen för dem också. I den andra studien Ng et al. De identifierar varianter i DHODH i alla tre familjer, med hjälp av filter för nya varianter som passar arvsmodeller. Dessa studier visade båda att exome-fångst är ett effektivt sätt att upptäcka orsakssamma varianter och gener och att korrekt diagnostisera ärftliga störningar orsakade av varianter i kända gener.

Nyligen gjorda framsteg i sekvensering av forntida DNA har också gynnats av målinriktad fångst.

(с) 2019 liceogalileinardo.it